Control of ERULUS and PERSEUS genes’ expression in Arabidopsis thaliana.

Abstract

Previous studies have confirmed that the RSL4 transcription factor is expressed in root hairs. In this work it was attempted to answer the question whether RSL4 may be responsible for the expression of many trichoblasts-specific genes, such as the two receptor-like kinase genes, namely At5g61350 (given the name ERULUS) and At3g07070 (given the name PERSEUS) using reverse genetics. These two kinases were studied in the present thesis. Expression of both kinase genes was tested by evaluating the activity of their promoter when each gene product was constructed in fusion with a GFP expressed in mutant Arabidopsis plants that did not express RSL4 (named as rsl4-1, knock out plants). Expression of ERULUS PERSEUS genes fused with GFP was clearly observed and resulted in new phenotype that grew root hairs. Thus, various tests were carried out to record the characteristics of this new mutant phenotype, by checking the size of shoots and siliques of rsl4-1 plants, the phenotype of the root hairs on different media, and finally comparing significant differences root hair growth by alterating the constitution of these media. Expression of ERULUS and PERSEUS kinases genes was observed in the rsl4-1 plants which were operating as knock outs (i.e. did not produce) to the RSL4 protein. It is concluded that the RSL4 protein is not the only transcription factor that regulates the expression of these two genes ERULUS and PERSEUS, but it appears that something else must be involved as well. In the second part of the experiments, wild type Arabidopsis was transformed with the promPER::PER-GFP construct to express the PERSEUS protein fused with GFP. This produced many independent lines of these transformants whose identification was based on phenotyping checks and PCR analysis. In the last part of this thesis, it was verified whether the promPER::PER-GFP construct results in production of an active GFP-tagged PER-proteins. From previous work from IMPRES group University of Antwerp the promPER::PER-GFP fusion was inserted into plants that had inactivated this gene (Perseus). Comparing these plants with perseus mutant plants that do not produced PERSEUS protein and with wild type plants, it was observed that perseus plants with the introduced GFP-tagged protein had the same root hair phenotype as the wild type, leading to the conclusion that PERSEUS-GFP protein works and can restore wild type root hair phenotype.

Σε αυτή την εργασία επιχειρήθηκε να δοθεί απάντηση στο ερώτημα κατά πόσον ο παράγοντας μεταγραφής RSL4 που εκφράζεται στα ριζικά τριχίδια, μπορεί να είναι υπεύθυνο για την έκφραση πολλών γονιδίων, που είναι ειδικά για τη δημιουργία τριχοβλαστών. Πιο συγκεκριμένα, στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν τα δύο γονίδια τύπου υποδοχέα κινάσης, At5g61350 (με το όνομα ERULUS) και At3g07070 (με το όνομα PERSEUS). Η γονιδιακή έκφραση των αμφοτέρων κινασών, εξετάστηκε με αξιολόγηση της δραστικότητας του υποκινητή τους, κατασκευάζοντας κάθε γονιδιακό προϊόν σε σύντηξη με GFP. Για τη μελέτη αυτή, το παραπάνω γονιδιακό προϊόν εισήχθη σε μεταλλαγμένα φυτά-δεν εκφράζουν την RSL4- Arabidopsis thaliana (rsl4-1 ή knock out φυτά). Η έκφραση των γονιδίων ERULUS και PERSEUS ενωμένων με GFP πράγματι παρατηρήθηκε και οδήγησε σε νέο φαινότυπο που αναπτύχθηκε με ριζικά τριχίδια. Έτσι, διεξάχθηκαν διάφορες δοκιμές για την καταγραφή των χαρακτηριστικών του νέου φαινοτύπου του μεταλλάκτη. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε έλεγχος του μεγέθους των βλαστών και των καψών των rsl4-1 φυτών, εξέταση του φαινοτύπου των ριζικών τριχιδίων σε διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα και τέλος, σύγκριση σημαντικών διαφορών στην ανάπτυξη των ριζικών τριχιδίων που προέκυψαν από την τροποποίηση αυτών των θρεπτικών υποστρωμάτων. Η έκφραση των γονιδίων κινασών ERULUS και PERSEUS παρατηρήθηκε στα φυτά rsl4-1, συμπεραίνοντας έτσι, ότι η συγκριμένη πρωτεΐνη δεν είναι ο μοναδικός μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την έκφραση των δύο αυτών γονιδίων. Στο δεύτερο μέρος των πειραμάτων, φυτά αγρίου τύπου Arabidopsis μετασχηματίστηκαν με το promPER::PER-GFP για να εκφράσουν την πρωτεΐνη PERSEUS συγχωνευμένη με GFP. Αυτό το προϊόν μετασχηματισμού, παρήγαγε πολλούς ανεξάρτητους απογόνους των οποίων η ταυτοποίηση βασίστηκε σε φαινοτυπικούς ελέγχους και ανάλυση PCR. Στο τελευταίο μέρος αυτής της διατριβής, εξετάστηκε εάν το κατασκεύασμα σύντηξης promPER::PER-GFP έχει ως αποτέλεσμα δραστική την συνδεδεμένη με GFP πρωτεΐνη PER. Από προηγούμενη εργασία της ομάδας IMPRES του Πανεπιστημίου της Αμβέρσας είχε εισαχθεί το κατασκεύασμα promPER::PER-GFP σε φυτά-Perseus ή knock out φυτά- που είχαν αδρανοποιημένο το γονίδιο που εκφράζει την πρωτεΐνη PER. Στα πλαίσια επαλήθευσης του τελευταίου μέρους της παρούσας εργασίας, πραγματοποιήθηκε σύγκριση αυτών των φυτών, με μεταλλαγμένα φυτά Perseus και με φυτά άγριου τύπου, παρατηρώντας πως τα φυτά με την εισαγόμενη πρωτεΐνη με σήμανση GFP, είχαν τον ίδιο φαινότυπο ριζικών τριχιδίων με αυτά του άγριου τύπου. Επομένως, προέκυψε το συμπέρασμα πως η πρωτεΐνη PERSEUS-GFP μπορεί να αποκαταστήσει το φαινότυπο των ριζικών τριχιδίων σε αυτό των φυτών άγριου τύπου.