Η χρήση της Real time PCR (RT- PCR) για την ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων στελεχών βακτηρίου (Escherichia coli).

Abstract

Η δυνατότητα ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης μίας προεπιλεγμένης αλληλουχίας DNA ή RNA μπορεί να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο σε τομείς όπως η ιατρική (π.χ. για διάγνωση ασθενειών), η μοριακή βιολογία, η ιατροδικαστική και η βιομηχανία τροφίμων (για ανίχνευση γενετικά τροποιημένων οργανισμών σε τρόφιμα). Η μέθοδος της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (συμβατική PCR) είναι μία από τις μεθόδους που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση προεπιλέγμενων αλληλουχιών. Η μέθοδος αυτή είναι η πρώτη μέθοδος που αναπτύχθηκε για αυτό το σκοπό το 1984 από τον Κerry Mullis και βασίζεται στην συνεχή επανάληψη τριών σταδίων σε κάθε κύκλο. Στην συνέχεια αναπτύχθηκαν και άλλες μέθοδοι που βασίστηκαν στην ιδέα της συμβατικής PCR και αποτέλεσαν παραλλαγές της αρχικής μεθόδου, όπως είναι η HotStart PCR, η Multiplex PCR και η Reverse transcriptase PCR (RT-PCR). H μέθοδος της Real Τime PCR αποτελεί μια παραλλαγή της συμβατικής μεθόδου, η οποία μπορεί να ενισχύσει, να ανιχνεύσει και να ποσοτικοποιήσει μια αλληλουχία-στόχο με μεγαλύτερη ταχύτητα και αποτελεσματικότητα. Μεγάλο πλεονέκτημα της μεθόδου αποτέλεσε η δυνατότητα παρακολούθησης της εξέλιξης της αντίδρασης σε οποιοδήποτε στάδιο της βρίσκεται η αντίδραση. Η λειτουργία της τεχνολογίας Real Τime PCR βασίζεται στην χρήση μηχανισμών ανίχνευσης, με τη βοήθεια ειδικών χρωστικών που διεγείρονται και εκπέμπουν συγκεκριμένου μήκους κύματος φώς, (λ), όπως η SybrGreen καθώς και ιχνηλατών (probes) αλλά και στις ειδικά διαμορφωμένες συσκευές Real Τime PCR που χρησιμοποιούνται για την εφαρμογή της. Οι συσκευές της Real Τime PCR βασίζονται τόσο στο σύστημα ανίχνευσης που διαθέτουν, για την ανίχνευση του σήματος που εκπέμπει ο εκάστοτε μηχανησμός ανίχνευσης, όσο και στο ειδικό λογισμικό με το οποίο αναλύονται τα αποτελέσματα που προκύπτουν κατά την διάρκεια της αντίδρασης. Σκοπός της παρούσας πειραματικής εργασίας είναι η ανίχνευση ενός γενετικά τροποποιημένου στελέχους του βακτηρίου Eschericia coli με την χρήση της τεχνικής της Real Τime PCR. Το στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε για την διεξαγωγή του πειράματος του βακτηρίου Escherichia coli είναι το JM83, το οποίο τροποποιήθηκε γενετικά με την προσθήκη του πλασμιδίου pESC-HIS-4CL. Το βασικότερο μέρος του πειράματος ήταν η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση των στελεχών με την μέθοδο της Real Τime PCR αλλά και με την συμβατική μέθοδο της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR). Η μέθοδος της συμβατικής PCR εφαρμόστηκε για σύγκριση της αποτελεσματικότητας των δύο μεθόδων. Τα αποτελέσματα που προήλθαν από την μέθοδο Real Τime PCR έδειξαν πως ήταν δυνατή η ανίχνευση του γενετικά τροποποιημένου στελέχους καθώς και η ποσοτικοποίηση των αντιγράφων σε κάθε δείγμα, ενώ το στέλεχος που δεν περιείχε το πλασμίδιο δεν έδωσε αντίγραφα της προεπιλεγμένης αλληλουχίας. Με την συμβατική PCR τα αποτελέσματα δεν ήταν τόσο ικανοποιητικά λόγω πιθανής επιμόλυνσης. Τα αποτελέσματα των δύο μεθόδων έδειξαν πως η μέθοδος της Real Τime PCR παρουσιάζει μεγαλύτερη ακρίβεια,ταχύτητα και λεπτομέρεια στην απόδοση των αποτελεσμάτων σε σχέση με την συμβατική PCR.