Ανίχνευση και ταυτοποίηση μέσω μεθοδολογίας PCR και REAL TIME PCR του φυτοπαθογόνου βακτηρίου Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Abstract

Η καλλιέργεια της πατάτας κατέχει την τέταρτη, σε οικονομική σημασία, θέση παγκοσμίως. Ο τόπος καταγωγής της είναι η Νότια Αμερική, όπου άγρια είδη της συναντώνται ακόμα και χρησιμοποιούνται για την παραγωγή γενετικά βελτιωμένων ποικιλιών. Ένα σημαντικό μέρος της παραγωγής πατάτας, παγκοσμίως, χάνεται από προσβολή των καλλιεργειών από φυτοπαθογόνους οργανισμούς. Εκτός από τους ιούς που ευθύνονται για το 50% των απωλειών παραγωγής, καταγράφονται απώλειες τα τελευταία χρόνια και από το φυτοπαθογόνο βακτήριο Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Το βακτήριο αυτό προκαλεί την ασθένεια της δακτυλιωτής σήψης σε φυτά και κονδύλους πατάτας και μόνο στην Ευρώπη οι εκτιμημένες ετήσιες απώλειες ανέρχονται σε 15 εκατομμύρια €. Η δυσκολία αντιμετώπισης της ασθένειας εντοπίζεται στην μη έγκαιρη διάγνωση της καθώς φυτά προσβεβλημένα από την ασθένεια σπάνια παρουσιάζουν συμπτώματα στο χωράφι. Έτσι, το βακτήριο μεταφέρεται μέσω των ασυμπτωματικών κονδύλων σε νέες σπορές της καλλιέργειας και μέσω του πολλαπλασιαστικού υλικού εισήλθε και στη Ελλάδα. Η Ευρωπαϊκή Ένωση σε μια προσπάθεια ελέγχου της ασθένειας εξέδωσε την κοινοτική οδηγία 93/85/ΕΕC όπου και περιγράφονται όλες οι μέθοδοι για την ανίχνευση του βακτηρίου σε φυτά και κονδύλους πατάτας. Οι ταχείες δοκιμές ανίχνευσης που χρησιμοποιούνται για την διαπίστωση της ύπαρξης του φυτοπαθογόνου μικροοργανισμού είναι ο ανοσοφθορισμός, η δοκιμή ELISA και η τεχνολογία της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Η τεχνολογία της PCR έχει εξελιχθεί σε ένα πολύτιμο διαγνωστικό εργαλείο προσφέροντας έγκυρα αποτελέσματα σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα ενώ οι διάφορες τεχνικές PCR που εφαρμόζονται στην φυτοπαθολογία είναι πολλές. Μία από τις τεχνικές αυτές είναι και η πολλαπλή PCR που πολλαπλασιάζει πολλά τμήματα επιθυμητού DNA σε μία μόνο αντίδραση. Στις νέες τεχνικές που εφαρμόζονται για την ανίχνευση του βακτηρίου Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus ανήκει και η τεχνολογία Real Time PCR. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό, την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA δίνοντας έτσι την δυνατότητα της παρακολούθησης της πορείας της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο. Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και η τεχνολογία Real Time PCR σε δείγματα που είχαν παρασκευαστεί από κονδύλους ύποπτους για μόλυνση από το βακτήριο της δακτυλιωτής σήψης. Πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις πολλαπλής (multiplex) PCR σε σαράντα δύο φυτικά εκχυλίσματα εκ των οποίων δεκατρία βρέθηκαν θετικά στην μόλυνση από Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, δεκαοχτώ δεν σχημάτισαν κανένα προϊόν ενώ σε έντεκα δείγματα δεν ανιχνεύθηκε το βακτήριο. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν την μέθοδο της πολλαπλής PCR ως μια γρήγορη και έγκυρη τεχνική για την ανίχνευση του βακτηρίου της δακτυλιωτής σήψης.