Μελέτη της μολυσματικότητας ιών σε φυτά τροποποιημένων μηχανισμών άμυνας.

Abstract

Στην παρούσα πτυχιακή εργασία μελετήσαμε την επίδραση της καταστολής διαφόρων πρωτεϊνών Dicer σε φυτά καπνού Nicotiana benthamiana, προσβεβλημένα από τρείς ιούς, τον ιό του πράσινου ποικολοχλωρωτικού μωσαϊκού της αγγουριάς (CGMMV), τον ιό του κροταλίσματος του καπνού, τροποποιημένο ώστε να εκφράζει τη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (TRV-GFP) και τον ιό της ευλογίας της δαμασκηνιάς (PPV). Επιλέξαμε φυτά N. benthamiana για την ευκολία της παρακολούθησης των συμπτωμάτων και για το μικρό βιολογικό κύκλο τους. Από τους τρεις ιούς, οι δυο πρώτοι (CGMMV και TRV-GFP) κανονικά δεν προκαλούν συμπτώματα στο N. benthamiana, σε αντίθεση με τον PPV ο οποίος προκαλεί συμπτώματα, επειδή το είδος αυτό ανήκει στους πειραματικούς του ξενιστές. Σκοπός της εργασίας ήταν η αξιολόγηση διαφόρων διαγονιδιακών φυτών N. benthamiana με καταστολή των πρωτεϊνών DICER στην αντίδρασή τους στη μόλυνση με διάφορους ιούς (TRV-GFP, CGMMV, PPV) για να διαπιστωθεί ποιες από αυτές τις πρωτεΐνες είναι σημαντικές για την άμυνα έναντι των παραπάνω ιών. Χρησιμοποιήσαμε τη σίγηση RNA (RNA silencing), ένα μηχανισμό άμυνας των φυτών που περιλαμβάνει την καταστολή της έκφρασης ξένου προς τον οργανισμό γονιδιακού υλικού όπως το προερχόμενο από ιούς, καθώς και μεταθετά στοιχεία, μέσω ενός συγκεκριμένου μηχανισμού αποδόμησης του RNA. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε φυτά N. benthamiana με κατεσταλμένες τις πρωτεΐνες D1, D2, D3, D4, και το συνδυασμό των D2 και D4 (D2/4) για να παρατηρήσουμε πόσο σημαντικές είναι αυτές οι πρωτεΐνες για τη σίγηση του ιικού RNA στα φυτά αυτά. Εξετάσαμε 3 παράγοντες: α) τα συμπτώματα που εμφανίστηκαν σε φυτά με κατεσταλμένη μια ή δυο διαφορετικές πρωτεΐνες Dicer β) τον φθορισμό στην υπεριώδη ακτινοβολία των παραπάνω φυτών όταν μολύνονται με τον ιό TRV-GFP και γ) την εκτίμηση του τίτλου (συγκέντρωσης) των διαφόρων ιών με ημιποσοτική ELISA. Από τα αποτελέσματα που πήραμε, είδαμε ότι η έλλειψη των πρωτεϊνών Dicer 2 και 4 είτε μόνων τους, είτε και των δυο ταυτόχρονα, επηρεάζει σημαντικά την σίγηση του ιικού RNA στα φυτά. Τα φυτά στα οποία έλειπαν οι πρωτεΐνες αυτές και είχαν μολυνθεί με τον TRV-GFP είχαν πολύ έντονο φθορισμό και συμπτώματα μωσαϊκού και παραμόρφωσης. Εκείνα που είχαν μολυνθεί με τον CGMMV παρουσίασαν ήπια συμπτώματα παραμόρφωσης, όταν τα αντίστοιχα φυτά αγρίου τύπου δεν παρουσίασαν κανένα σύμπτωμα. Αντίθετα, η μόλυνση με τον PPV δεν φάνηκε να επηρεάζεται σε ότι αφορά τη συμπτωματολογία και τη συγκέντρωση του ιού από την έλλειψη των Dicers. Άρα τα συμπτώματα που εμφανίζονται στο N. benthamiana δεν εξαρτώνται μόνο από το είδος των Dicer που καταστέλλονται ή λειτουργούν, αλλά και από το είδος του ιού.