Διεξαγωγή βιοδόκιμων για τη διερεύνηση ανάπτυξης ανθεκτικότητας του εκτοπαράσιτου της μέλισσας Varroa Destructor Anderson & Trueman στα ακαρεόκτονα.

Abstract

Το φαινόμενο της ανθεκτικότητας του βαρρόα που έχει παρατηρηθεί τα τελευταία χρόνια, έχει προκαλέσει ιδιαίτερα μεγάλο προβληματισμό στον κλάδο της μελισσοκομίας. Το άκαρι βαρρόα, Varroa destructor, ανήκει στην οικογένεια Varroidae και τάξη Acarina. Αποτελεί το σοβαρότερο παράσιτο της μέλισσας σε παγκόσμιο επίπεδο. Προσβάλλει τόσο τις ακμαίες μέλισσες, όσο και τα ατελή στάδια, δηλαδή προνύμφες και πλαγγόνες, απομυζώντας την αιμολέμφο και μειώνοντας την διάρκεια ζωής της μέλισσας. Επίσης, είναι φορέας σοβαρών ιώσεων που ζημιώνουν περαιτέρω τις μέλισσες, όπως ο ιός των παραμορφωμένων φτερών και ο ιός της σακκόμορφης σηψιγονίας. Στην χώρα μας το βαρρόα εντοπίστηκε το 1978 στην περιοχή του Έβρου, ενώ εικάζεται ότι εισέβαλε από τη Βουλγαρία, Γιουγκοσλαβία και πιθανόν την Τουρκία το 1975. Για πολλά χρόνια σε παγκόσμιο επίπεδο υπήρχε λανθασμένος σχεδιασμός αντιμετώπισης του βαρρόα, που αυτό είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας. Στόχος της συγκεκριμένης πτυχιακής εργασίας είναι να βρεθεί ο βαθμός ανθεκτικότητας του βαρρόα στις 4 δραστικές ουσίες που χρησιμοποιούνται (coumaphos, flumethrin, tau-fluvalinate, amitraz) σε πληθυσμούς στον Ν. Ρεθύμνου. Ο έλεγχος του επιπέδου της ανθεκτικότητας των βαρρόα έγινε με τη χρήση φιαλιδίων όγκου 4 mL, η εσωτερική επιφάνεια των οποίων είχε επενδυθεί με ακαρεοκτόνο. Χρησιμοποιήθηκαν οι διαγνωστικές συγκεντρώσεις θνησιμότητας του 90% του ευαίσθητου πληθυσμού (LD90), οι οποίες προέκυψαν από μεταδιδακτορική έρευνα που διεξήχθη στο πλαίσιο της Πράξης «Εκπόνηση Σχεδίων Ερευνητικών & Τεχνολογικών Αναπτυξιακών Έργων Καινοτομίας (ΑγροΕΤΑΚ)». Οι διαγνωστικές συγκεντρώσεις είναι 10,9, 7,3, 15,5 και 4,7 μg/φιαλίδιο για τις 4 δραστικές ουσίες coumaphos, amitraz, tau-fluvalinate και flumethrin αντίστοιχα. Για την πραγματοποίηση των βιοδοκιμών, συλλέχθηκαν βαρρόα με τη βοήθεια εντομολογικής λαβίδας από κηρήθρες με ζωντανό γόνο που δόθηκαν από μελισσοκόμους. Τα κελιά ανοίχθηκαν και απομακρύνθηκε η μέλισσα (προνύμφη ή πλαγγόνα), ενώ παράλληλα συλλέγονταν τυχόν βαρρόα που υπήρχαν πάνω της ή εντός του κελιού. Όταν συλλέχθηκε επαρκής αριθμός βαρρόα, αυτά μεταφέρονταν στα φιαλίδια, 5-10 τον αριθμό ανάλογα με τη διαθεσιμότητα. Τα φιαλίδια διατηρήθηκαν μακριά από το φως και σε θερμοκρασία 27-29 °C για τρεις ώρες. Κατόπιν, γινόταν έλεγχος των ζωντανών και νεκρών βαρρόα, σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Ζωντανό θεωρήθηκε το βαρρόα που είναι ικανό να διανύσει απόσταση μεγαλύτερη από το διπλάσιο του σωματός του, ενώ νεκρό το βαρρόα που δεν αντιδρά σε ερέθισμα ή ‘τρεμουλιάζει’, χωρίς να μπορεί να μετακινηθεί, δείγμα ότι έχει επηρεαστεί σημαντικά από το φάρμακο και θα πεθάνει σύντομα. Με βάση τα αποτελέσματα, φαίνεται ότι υπάρχει πρόβλημα αποτελεσματικότητας του tau-fluvalinate, αφού η μέση αποτελεσματικότητά του ήταν 37,5%. Μέτρια ήταν αποτελεσματικότητα του coumaphos και του amitraz (66,1% και 64,3% αντίστοιχα), ενώ υψηλή ήταν η θνησιμότητα στο flumethrin (83,9%). Η χαμηλή θνησιμότητα στο tau-fluvalinate μπορεί να εξηγηθεί από την ευρεία χρήση του (22 από τις 76 εφαρμογές), σε συνδυασμό με το μικρό κόστος προσαρμοστικότητας (fitness cost) της ανθεκτικότητας. Σε ότι αφορά το amitraz, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι πιο περίπλοκη. Λόγω της ευρύτατης χρήσης του (29 εφαρμογές σε σύνολο 76), θα περίμενε κανείς να έχει πολύ μικρότερη αποτελεσματικότητα. Φαίνεται, όμως, ότι η ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε αυτή τη δραστική ουσία είναι δύσκολη λόγω της διπλής δράσης του σε υποκυτταρικό επίπεδο. Το coumaphos χρησιμοποιήθηκε 16 φορές και είχε μέτρια αποτελεσματικότητα. Τέλος, το flumethrin δε χρησιμοποιήθηκε καμία φορά, και, λογικά, είχε υψηλή αποτελεσματικότητα. Θα περίμενε κανείς ότι η ανθεκτικότητα στο tau-fluvalinate θα σήμαινε αυτόματα και ανθεκτικότητα στο flumethrin λόγω ίδιου μηχανισμού δράσης (cross-resistance), με την προϋπόθεση ότι η ανθεκτικότητα οφείλεται σε αλλαγή του στόχου (target-site resistance). Από την άλλη, αν η ανθεκτικότητα οφειλόταν σε αυξημένη αποτοξικοποίηση των ακαρεοκτόνων (metabolic resistance), θα έπρεπε να είχε παρατηρηθεί και στις άλλες δραστικές ουσίες. Θα πρέπει να τονιστεί μία παράμετρος που ενδεχομένως οδηγεί σε σημαντική παραλλακτικότητα των αποτελεσμάτων. Στην Κρήτη, οι μελισσοκόμοι κάθε χρόνο το φθινόπωρο, συνωστίζονται στα πευκοδάση του νησιού προκειμένου να εκμεταλλευτούν τη μελιτοφορία του πεύκου. Η πυκνότητα των μελισσιών είναι τεράστια και λαμβάνει χώρα σε έντονο βαθμό το φαινόμενο της παραπλάνησης των μελισσών, κατά το οποίο οι μέλισσες μπερδεύονται και εισέρχονται σε άλλη κυψέλη από τη δική τους. Και επειδή συχνά οι μέλισσες αυτές μεταφέρουν στο σώμα τους βαρρόα, έχουμε μεταφορά του ακάρεος από κυψέλη σε κυψέλη. Με αυτόν τον τρόπο, γίνεται ανάμειξη του γενετικού υλικού του βαρρόα και είναι πολύ δύσκολο να γίνει ακριβής συσχέτιση του ποσοστού θνησιμότητας με το ιστορικό καταπολέμησης. Όμως, ακόμα και αν δεχτούμε αυτό το γεγονός ως δεδομένο, το amitraz χρησιμοποιείται από όλους τους μελισσοκόμους που χρησιμοποιούν συνθετικά ακαρεοκτόνα. Η μέτρια θνησιμότητα των πληθυσμών δείχνει ότι ενδεχομένως το βαρρόα να δυσκολεύεται να αναπτύξει ανθεκτικότητα σε αυτή τη δραστική ουσία.

Resistance development in Varroa mite during the past years has caused heavy thinking in Apiculture. Varroa destructor Anderson & Trueman is an ectoparasitic mite of the family Varroidae. It is the most significant honey bee pest worldwide, infecting both adults and honey bee brood by sucking of the haemolymph and thus reducing the lifespan of adults, if not kill the brood inside the brood cell. Additionally, the mite is a vector of a number of viruses, e.g. the deformed wing virus and the sacbrood virus. In Greece, the mite was first identified in 1978, at the region of Evros in Southeastern edge of the country. It is believed to have invaded from Bulgaria or Yugoslavia and possibly Turkey in 1975. For many years, severe mistakes repeatedly were taking place, resulting to the development of resistance. The aim of this Thesis is to investigate the resistance development of Varroa mite to four acaricides used in Rethumnon prefecture, namely coumaphos, flumethrin, tau-fluvalinate and amitraz. Bioassays were applied using 4 mL glass vials, the inner surface of which was covered with the acaricides under investigation. Diagnostic concentrations (LD90¬) employed were 10.9, 7.3, 15.5 and 4.7 μg/vial for coumaphos, amitraz, tau-fluvalinate and flumethrin respectively. These concentrations were estimated during a postdoctoral thesis for the Action “AgroETAK, Research and Technology Development Innovation Projects” Varroa mites used in the bioassays were collected from brood frames provided from local beekeepers. In total, seven populations were used and a total of 280 mites were employed in the bioassays. Brood cells were opened using entomological forceps and the brood was removed, while the mites were collected with a fine brush. Mites were kept in pietri dishes with 2-3 larvae as food supplement. When a sufficient number of mites were collected, 5-10 (regarding availability) were transferred to the vials. Vials were kept in the dark, at 27-29 °C for three hours and then. Mites were then checked for vigor and designated as ‘alive’ if they could run a distance double their size, while ‘dead’ were considered those trembling or unable to move. Based on the results, it seems that Varroa mites have developed resistance to tau-fluvalinate since average mortality was as low as 37.5%. Moderate efficacy for coumaphos and amitraz, with average mortality of 66.1% and 64.3% respectively. The most efficient acaricide proved to be flumethirn, with average mortality reaching 83.9%. Low mortality to tau-fluvalinate can be explained due to its wide use (22 out of 76 applications since 2012), probably in combination to the low fitness cost of point mutations for pyrethroid resistance. Results regarding amitraz are not that easy to explain. This acaricide was used 29 times out of 76 applications, thus one would expect high resistance incidence. It seems that resistance is not easy to evolve due to the double mode of action of amitraz in the nervous system. Coumaphos was used 16 times and the efficacy was expectedly moderate. Finally, flumethrin was not used in any of the seven populations and high mortality of Varroa could be expected. Nevertheless, since flumethrin and tau-fluvalinate share the same mode of action, resistance to tau-fluvalinate should cause resistance to flumethrin due to cross-resistance, supposing the resistance mechanism is target site mutation. The results here could be explained if we accept a second resistance mechanism, metabolic detoxification, to which flumethrin shows resistance. A parameter that should be taken into account trying to explain these results is the fact that in Crete, beekeepers transport their beehives to pine forests, in order to exploit honeydew secretions. Hive density is extremely high and forager bees are misled to a hive other than their own, hence mites are transported from hive to hive. In this way, a mix of genetic material of Varroa mites is inevitable, making very difficult the correlation of bioassay results with application history in a hive. This, however, is not the case for amitraz, an acaricide generally used by all beekeepers, and moderate mortality of Varroa shows that resistance is not easy to develop.