Αξιολόγηση διαφορετικών υποστρωμάτων στην in vitro ριζοβολία εκφύτων αλόης (Aloe vera L.) για επιχειρηματική παραγωγή υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού.

Abstract

Η Aloe vera L., θεωρείται ένα πολύ σημαντικό φυτό, ανήκει στην οικογένεια των κρινοειδών (Liliaceae) και έχει μεγάλη σπουδαιότητα στην βιομηχανία φαρμακευτικών και καλλυντικών ειδών. Λαμβάνοντας υπ’ όψην την φαρμακευτική και εμπορική σημασία, η Aloe vera L. είναι γνωστή και ως βότανο θαύμα’ (“miracle-herb”). Από τα 300 περίπου διαφορετικά είδη αλόης που έχουν καταγραφεί, η Aloe barbadensis γνωστή και ως Aloe vera είναι η πλέον διαδεδομένη. Η καλλιέργειά της αποδίδει τα μέγιστα σε ηλιόλουστες περιοχές χωρίς πρόβλημα χαμηλών θερμοκρασιών, σε εδάφη με καλή στράγγιση ακόμη και σε φτωχά εδάφη. Η Αloe vera L., έχει πολύτιμες φαρμακευτικές ιδιότητες, καθώς στο όνομά της αναγράφεται ένα πραγματικό οπλοστάσιο απαραίτητων και σημαντικών στοιχείων (ένζυμα, βιταμίνες, πρωτεΐνες, αμινοξέα, μέταλλα, έλαια, πολυσακχαρίδια, μονοσακχαρίδια κ.α.), με αποτέλεσμα να έχει μεγάλη ζήτηση σε εταιρίες τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών προϊόντων. Επιπλέον από τις πιο σημαντικές φαρμακολογικές ιδιότητες της Aloe vera L. είναι η θεραπεία σε πληγές και εγκαύματα, αλλά και η αντιβακτηριακή, αντιϊκή, αντιμυκητιακή, αντικαρκινική, αντισηπτική και αντιδιαβητική δράση (Barandozi, 2013, Khanam and Sharma, 2013). Η αναπαραγωγή του φυτού μπορεί να γίνει εγγενώς και αγενώς. Ο εγγενής πολλαπλασιασμός γίνεται με σπόρο, ο οποίος σπέρνεται σε σπορεία και σε καλά αποστραγγισμένα εδάφη, με θερμοκρασία από 20-250C. Τα υψηλά ποσοστά στειρότητας των αρσενικών ανθέων και η δυσκολία βλάστησης του σπόρου (απαιτούνται τρεις έως τέσσερις περίπου εβδομάδες) θεωρούνται δύο από τα μεγαλύτερα προβλήματα του εγγενή πολλαπλασιασμού (Natali L. et al., 1990). Ο παραδοσιακός τρόπος αναπαραγωγής της αλόης είναι ο in vivo αγενής πολλαπλασιασμός. Από τα ενήλικα φυτά αποκόπτονται παραφυάδες, οι οποίες αρχικά καλλιεργούνται σε φυτώριο και όταν φθάσουν τα 15-20 cm μεταφέρονται στον αγρό. Το βασικό μειονέκτημα του συγκεκριμένου τρόπου πολλαπλασιασμού εστιάζεται στο γεγονός ότι εάν τα μητρικά φυτά (δωρητές) φέρουν παθογόνους οργανισμούς (που μεταφέρονται με το αγενές Π.Υ.) και τα θυγατρικά θα είναι μολυσμένα, με αποτέλεσμα τη μειωμένη απόδοση και το γρήγορο εκφυλισμό της φυτείας. Προβλήματα φυτοϋγείας συνήθως δημιουργούν τα βακτήρια του γένους Erwinia (Laat et al., 1994), οι μύκητες του γένους Alternaria και Fusarium (Kawuri et al., 2012), και οι νηματώδεις του γένους Meloidogyne (Palomares-Rius et al., 2015). Παγκοσμίως η παραγόμενη ποσότητα αλόης δεν αρκεί για να καλύψει τις συνεχώς αυξανόμενες ανάγκες ζήτησης, γεγονός που οδηγεί σε αύξηση της καλλιεργούμενης έκτασης καθώς και στη χρήση πολλαπλασιαστικού υλικού εγγυημένης ποιότητας. Η αξιοποίηση του μικροπολλαπλασιασμού (in vitro culture) καλύπτει τις σύγχρονες απαιτήσεις της καλλιέργειας καθόσον παρέχει αναμφισβήτητα πλεονεκτήματα έναντι των συμβατικών μεθόδων, όπως είναι η γενετική ομοιομορφία του παραγόμενου Π.Υ., το υψηλό επίπεδο φυτοϋγείας των κλωνικών φυτών, η αυξημένη παραγωγή φυτών σε σύντομο χρονικό διάστημα, η εξοικονόμηση χώρου, η προστασία της παραγωγής από εξωτερικές περιβαλλοντικές συνθήκες κ.ά. Αρκετές μελέτες έχουν αναφερθεί στον in vitro πολλαπλασιασμό της αλόης (Gantait et al., 2010, Khanam and Sharma, 2013, Γραμματικάκη κ.ά. 2015). Στόχος της παρούσης μελέτης είναι η αξιολόγηση της επίδρασης τριών αυξινών {a-naphthaleneacetic acid (ΝΑΑ), Indole-3-butyric acid (IBA), Indole-3-acetic acid (IAA) }, καθώς επίσης και του ζελέ αλόης (aloe gel) με σκοπό την ανάπτυξη πρωτοκόλλου για μαζική παραγωγή Π.Υ. αλόης με in vitro τεχνολογία . Χρησιμοποιήθηκαν μοσχεύματα αλόης, τα οποία διατηρούνται σε θάλαμο ελεγχομένων συνθηκών ανάπτυξης (θερμοκρασία 25 ± 0,50C, 16 ώρες φωτοπερίοδο και ένταση φωτισμού περίπου 3.500 Lux) και σε in vitro συνθήκες. Τα συγκεκριμένα μοσχεύματα καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα με διαφορετικές συγκεντρώσεις NAA, ΙΒΑ και ΙΑΑ, ενώ το ζελέ αλόης χρησιμοποιήθηκε σε ποσοστά που κυμάνθηκαν από 10 -100%. Συγκεκριμένα η αποτελεσματικότητα της in vitro παραγωγής Π.Υ. αλόης μελετήθηκε αξιοποιώντας 18 διαφορετικά υποστρώματα (συμπεριλαμβανομένου του μάρτυρα). Ως υπόστρωμα βάσης χρησιμοποιήθηκε το Murashige and Skoog 1962, εμπλουτισμένο με θειαμίνη HCl (2 mg/l), ινοζιτόλη (100 mg/l), σακχαρόζη (30 g/l) και άγαρ (7,5 g/l), με pH 5,8. Επιπλέον αξιοποιήθηκαν : το ΝΑΑ (συγκέντρωση 0.5, 1.0, 1.5 και 2,0mg/L), το ΙΒΑ (συγκέντρωση του 0.5, 1.0, 1.5 και 2,0mg/L) και το ΙΑΑ (συγκέντρωση του 0.5, 1.0, 1.5 και 2,0mg/L). Όσον αφορά το ζελέ αλόης (aloe gel) αξιοποιήθηκε σε ποσοστό: 10%, 15%, 25%, 50% και 100%. Για κάθε υπόστρωμα έγιναν 5 επαναλήψεις με 8 έκφυτα ανά επανάληψη (18x5x8), δηλαδή συνολικά καλλιεργήθηκαν 720 έκφυτα, τα οποία μεταφέρθηκαν σε θάλαμο ελεγχόμενων συνθηκών ανάπτυξης για 2,5 περίπου μήνες. Ακολούθησε η αξιολόγηση καταγράφοντας τον αριθμό και το μήκος των βλαστών, τον αριθμό των φύλλων, τον αριθμό και το μήκος των ριζών, καθώς και το νωπό βάρος κάθε συστάδας. Έγινε ο εγκλιματισμός των vitro-φυταρίων και η αξιολόγηση τους σε in vivo συνθήκες. Η στατιστική δοκιμασία έγινε συγκρίνοντας τις μέσες τιμές με τη δοκιμή Duncan.

Aloe vera (L.), the so-called 'miracle' plant, is widely used in the pharmaceutical, food and cosmetic industry, due to the abundance of biological activities of some primary and secondary metabolites. The cultivation of the widespread species Aloe barbadensis, also known as Aloe vera, yields the most in sunny areas without the problem of low temperatures, in well-drained soils or even in poor soils. To avoid plant health problems perpetuated by in vivo vegetative propagation, the utilization of in vitro propagation provides the best guarantees. In order to develop a protocol for rapid and economical production of Aloe vera plantlets with in vitro technology, the effect of three growth auxins [a-naphthalene acetic acid (NAA), Indole-3-butyric acid (IBA), Indole-3-acetic acid (IAA) and Aloe vera gel to induce rooting was evaluated. Apical peak shoots after macroscopic and laboratory examination for absence of common pathogens, were implanted in a nutrient substrate of Murashige and Skoog (1962) and remained in a growth chamber (25 ± 0,50 C, 16 hours photoperiod and 3,500 Lux intensity lighting) for four weeks. With a series of successive sub-cultures, a sufficient number of plants have been created to carry out the experiment. Eighteen different substrates were created based on Murashige and Skoog (1962), enriched with Thiamin HCl (2 mg / L), inositol (100 mg / L), sucrose (30 g / L) and agar (7.5 g / L), pH 5.8. Four of these were supplemented with NAA (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 mg / L), four with IBA (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 mg / L), four with IAA (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 mg / L), five with aloe gel (10%, 15%, 25%, 50% and 100%) and one remained as a control. For each substrate there were five repetitions with eight explants per repetition, i.e. a total of 720 (18 x 5 x 8) were cultivated. After two months, the number and length of the shoots, the number and length of the roots, the number of leaves and the fresh weight of each cluster were recorded. The statistical analysis was carried out by comparing the average values of the total 18 treatments with the Duncan criterion (P = 0.05). The concentration 0.5 mg/l ΙΑΑ was distinguished in the following characteristics: number of shoots per explant (3.46), number of leaves per explant (25.63) and number of roots per explant (10.6). The substrate containing 1.5 mg/l NAA prevailed in the following 3 characteristics: length of roots (6.96 cm), shoots height (5.14 cm) and fresh weight (3.86 g). Shoot proliferation and adventitious root formation appeared significantly lower in substrates containing IBA and those with Aloe vera gel. In the international bibliography, the "yields" of rizogenesis vary depending on the type and concentration of "growth" regulators. Of course, the final judgment on the most efficient and economical protocol is determined by the survival rate in the process of acclimatization of microplants. Our results showed that substrates contained auxins had the maximum viability [reached to 100% with the notable exception of NAA (2mg/L) until 83,3%]. On the contrary, explants which had been cultured in the Aloe vera gel medium, did not respond as well to acclimatization, giving lower rates of viability (60-80%).