Λειτουργική ανάλυση γονιδίων ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα, με βιοτεχνολογικές προσεγγίσεις αντίστροφης γενετικής.

Abstract

Η γενετική μηχανική αποτελεί ένα από τους πιο σημαντικούς κλάδους της μοριακής βιολογίας, που επιτρέπει την εις βάθος λειτουργική ανάλυση των βιολογικών μηχανισμών. Από τα πιο δημοφιλή μοριακά εργαλεία της γενετικής μηχανικής των τελευταίων ετών είναι το σύστημα CRISPR/Cas9, το οποίο επιτρέπει την ελεγχόμενη και στοχευμένη τροποποίηση του γονιδιώματος. Η τεχνολογία βασίζεται στην RNA-κατευθυνόμενη στόχευση και δημιουργία θραυσμάτων από την ενδονουκλεάση Cas9 στην επιθυμητή περιοχή του γονιδιώματος. Μέσω της ενεργοποίησης των μηχανισμών επιδιόρθωσης του κυττάρου είναι εφικτά η απαλοιφή μίας γενωμικής περιοχής ή αντικατάσταση αυτής με τεχνητά τμήματα DNA που φέρουν επιθυμητές σημειακές μεταλλαγές. Η μεθοδολογία CRISPR/Cas9 έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα τα τελευταία χρόνια για την απόδειξη συσχέτισης γενότυπου-φαινότυπου. Χαρακτηριστικό παράδειγμα στο χώρο της εντομολογίας αποτελεί η χρήση της τεχνολογίας αυτής σε οργανισμούς μοντέλα (Drosophila) με σκοπό τη λειτουργική ανάλυση σημειακών μεταλλαγών σε γονίδια στόχους εντομοκτόνων και τη συνεισφοράς αυτών στο φαινότυπο της ανθεκτικότητας. Παρόλα αυτά, η χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9 είναι αρκετά περιορισμένη σε οργανισμούς μη-μοντέλα. Αντικείμενο της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξης και εφαρμογή της μεθοδολογίας CRISPR/Cas9 στο λεπιδόπτερο S. frugiperda, έναν από τους σημαντικότερους εχθρούς των καλλιεργούμενων φυτών. Για το σκοπό αυτό θα γίνει στόχευση του γονιδίου-μάρτυρα Scarlet, διατάραξη του οποίου δίνει φαινότυπο στα ακμαία στάδια των εντόμων. Στόχος της παρούσας εργασίας αποτελεί η ανάπτυξη της μεθοδολογίας της γενετικής τροποποίησης στο S. frugiperda (proof of concept) προκειμένου μελλοντικά να χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση του ρόλου γονιδίων-στόχων στη φυσιολογία των εντόμων.

Genetic engineering is one of the most important branches of molecular biology, which allows in-depth functional analysis of biological mechanisms. One of the most popular molecular tools in genetic engineering in recent years is the CRISPR / Cas9 system, which allows controlled and targeted modification of the genome. The technology is based on RNA-directed targeting and generation of Cas9 endonuclease fragments in the desired region of the genome. By activating the cell repair mechanisms, it is possible to delete a genomic region or replace it with artificial DNA fragments that carry desired point mutations. The CRISPR / Cas9 methodology has been used extensively in recent years to demonstrate genotype-phenotype correlation. A typical example in the field of entomology is the use of this technology in model organisms (Drosophila) for the purpose of functional analysis of point mutations in genes of insecticide targets and their contribution to the phenotype of resistance. However, the use of the CRISPR / Cas9 system is quite limited in non-model organizations. The object of the present work is the development and application of the CRISPR / Cas9 methodology in the lepidoptera Spodoptera frugiperda, one of the most important enemies of cultivated plants. For this purpose, the Scarlet control gene will be targeted, the disruption of which gives phenotype in the prosperous stages of insects. The aim of the present study is to develop the methodology of genetic modification in S. frugiperda (proof of concept) in order to be used in the future to investigate the role of target genes in insect physiology.