Κλωνοποίηση και έκφραση του τροποποιημένου γονιδίου της νεφρικής αποκαρβοξυλάσης της dopa στο Escherichia coli.

Abstract

Οι φυτικοί δευτερογενείς μεταβολίτες είναι οργανικές ενώσεις οι οποίες δεν είναι απαραίτητες για τις φυσιολογικές λειτουργείες του φυτού έχουν όμως βασικό ρόλο στην άμυνά του καθώς και στην προσαρμογή του στο περιβάλλον. Του παρέχουν προστασία ενάντια σε αβιοτικούς και βιοτικούς παράγοντες και κατηγοριοποιούνται σε τρείς μεγάλες ομάδες, τα αλκαλοειδή, τα τερπένια και την ομάδα των φαινολικών ουσιών. Στην τελευταία ανήκουν διάφορες ουσίες που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για την θετική επίδραση που έχουν στην υγεία του ανθρώπου με μια απ’ αυτές να είναι η υδροξυτυροσόλη. Η υδροξυτυροσόλη (3,4 Dihydroxyphenylethanol) είναι ένας δευτερογενής μεταβολίτης της ελιάς (Olea europaea) ο οποίος συναντάται κυρίως στα φύλλα αλλά και τους καρπούς σε μικρότερες ποσότητες. Είναι γνωστή για τις ευεργετικές, για την υγεία του ανθρώπου και κυρίως για την αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή και αντιφλεγμονώδη δράση. Η υδροξυτυροσόλη μπορεί να παραχθεί με την χρήση μεθόδων μεταβολικής μηχανικής όπου ένας μικροοργανισμός, όπως το Escherichia coli, τροποποιείται ώστε να την παράγει. Η βιοσύνθεση της υδροξυτυροσόλης επιτυγχάνεται μέσω της τροποποίησης δύο γονιδίων. Το γονίδιο της τυροσινάσης από το βακτήριο Ralstonia solanacearum και το γονίδιο της συνθάσης των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων από τον μαϊντανό. Η έκφραση αυτών των δύο γονιδίων στο E.coli επιτρέπει την παραγωγή της υδροξυτυροσόλης μέσα από την δημιουργία ενός διπλού βιοσυνθετικού μονοπατιού που ξεκινάνε από την τυροσίνη, επειδή το καθένα από τα δύο προαναφερθέντα γονίδια μπορεί να δεχτεί δύο διαφορετικά υποστρώματα. Η τυροσινάση μπορεί να δεχθεί την τυροσίνη και την τυροσόλη, ενώ η συνθάση των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων μπορεί να δεχθεί την τυροσίνη και την DOPA. Στην εργασία αυτή επιχειρήθηκε η βελτιστοποίηση του μονοπατιού με την αντικατάσταση της συνθάσης των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων από ένα γονίδιο που δέχεται ως υπόστρωμα μόνο την DOPA. Επιλέχθηκε το τροποποιημένο γονίδιο της νεφρικής αποκαρβοξυλάσης της DOPA από τον χοίρο (SsDDC) το οποίο δέχεται ως υπόστρωμα μόνο την DOPA δημιουργώντας ένα μονόδρομο μονοπάτι στην παραγωγή υδροξυτυροσόλης. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία το SsDDC μετά από την αλλαγή της τυροσίνης 332 σε φαινυλαλανίνη έχει την ιδιαιτερότητα να πραγματοποιεί ταυτόχρονη απαμίνωση και αποκαρβοξυλίωση στην DOPA. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την δράση του SsDDC ως συνθάση των αρωματικών φαινυλακεταλδεϋδων (DHPAS) και την παραγωγή της αντίστοιχης αλδεΰδης πραγματοποιώντας δύο βήματα του μονοπατιού στην ίδια αντίδραση. Για να ελεγχθεί η ενεργότητα του DHPAS ως προς το υπόστρωμα και τελικά η παραγωγή της υδροξυτυροσόλης, σχεδιάστηκαν in vitro αντιδράσεις με υπόστρωμα την τυροσίνη αλλά και την DOPA. Στις in vitro αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από βακτηριακές καλλιέργειες E. coli από διαφορετικές επαγωγικές συνθήκες (συγκέντρωσης επαγωγέα IPTG). Τα αποτελέσματα από τις in vitro αντιδράσεις δεν έδειξαν καμία ενεργότητα του κλωνοποιημένου γονιδίου DHPAS από τον χοίρο πάνω στην τυροσίνη και την DOPA στις συνθήκες εκτέλεσης του πειράματος.

Plant secondary metabolites are organic compounds that they are not necessary for the plant growth, although, they play major role in the plants defense and environmental adaptation. They are responsible for the plants defense against biotic and abiotic factors and they are classified in three major groups, alkaloids, terpenes and the phenolic compounds. Many deferent compounds belonging in the latter group are interesting for the potential benefits in human health with hydroxytyrosol being one of them. Hydroxytyrosol (3,4 Dihydroxyphenylethanol) is a secondary metabolite that is produced mainly in the leaves of the olive tree (Olea europaea) and also in the fruits in lower concentrations. It is known for its beneficial effects in human health with some of them being, antioxidant, antimicrobial and anti-inflammatory activities. Using metabolic engineering methods microorganisms, such as Escherichia coli, can be genetically modified to produce hydroxytyrosol. Biosynthesis of hydroxytyrosol is achieved by modifying two genes. The tyrosinase gene taken from the bacterium Ralstonia solanacearum and the synthase of aromatic phenylacetaldehyde gene taken form parsley. The expression of those two genes in E. coli allows the production of hydroxytyrosol with the formation of a dual pathway starting from tyrosine, this is due to the fact that the aforementioned genes can bind to two different substrates. Tyrosinase can bind to tyrosine and tyrosol whereas synthase of aromatic phenylacetaldehyde binds to tyrosine and DOPA. This thesis attempts to optimize the biosynthetic pathway of hydroxytyrosol by replacing synthase of aromatic phenylacetaldehyde gene with a gene that binds only to DOPA. The modified gene DOPA decarboxylase (SsDDC), taken from the pig kidney, was chosen which binds to DOPA alone thus generating a singular pathway for the production of hydroxytyrosol. According to the bibliography, after substituting tyrosine 332 to phenylalanine in the SsDDC the enzyme is capable of catalyzing decarboxylation and deamination reactions to DOPA at the same time. This means that the SsDDC acts as a synthase of aromatic phenylacetaldehyde (DHPAS) and leads to the production of the corresponding aldehyde thus performing two steps of the hydroxytyrosol pathway in the same reactions. For the examination of DHPAS activity regarding substrate specificity and finally the production of hydroxytyrosol in vitro reaction were designed with dopa and tyrosine as substrates. Total protein extracts from E. coli bacterial cultures that were previously exposed to different inductive conditions (inducer concentrations, IPTG) were used for the in vitro reactions. The results from the in vitro reactions showed no activity of the cloned pig DHPAS gene against tyrosine or DOPA at the given conditions that the experiment was conducted.