Αξιολόγηση της επίδρασης διαφορετικών μεθόδων βλάστησης σπόρων σπαραγγιού (Asparagus officinalis L.) σε in vitro συνθήκες.

Abstract

Το Asparagus officinalis L. είναι αυτοφυές πολυετές είδος και ανήκει στην οικογένεια των Asparagaceae. Από τα 200 είδη του γένους Asparagus το A. officinalis είναι το πιο διαδεδομένο εδώδιμο είδος. Το σπαράγγι αποτελείται από το υπόγειο μέρος (ρίζωμα και σαρκώδεις ρίζες) και το υπέργειο (βλαστοί, φύλλα και άνθη). Το εδώδιμο τμήμα είναι οι βλαστοί (spears) και συγκομίζονται πριν το άνοιγμα της κορυφής. Το A. officinalis L. είναι δίοικο, ή σπάνια ανδρομονόικο, μονοκότυλο, με ορθόκλαδη ανάπτυξη. Τα άνθη του είναι μονήρη ή βλαστάνουν σε ομάδες των 2-3. Υπάρχουν ομογαμετικά θηλυκά είδη (ΧΧ), ετερογαμετικά αρσενικά είδη (ΧΥ) και ομογαμετικά αρσενικά είδη (ΥΥ). Τα τελευταία παρήχθησαν από επιχιασμό ετερογαμετικών αρσενικών. Τα ετερογαμετικά αρσενικά θεωρούνται ως παραγωγικότερα, ζωηρότερα και αποδοτικότερα των θηλυκών ενώ τα ομογαμετικά αρσενικά είναι ανθεκτικότερα σε διάφορες ασθένειες και δεν παράγουν σπόρους. Ο πολλαπλασιασμός του σπαραγγιού γίνεται με ριζώματα (αγενής πολλαπλασιασμός), όμως για την παραγωγή των ριζωμάτων, χρησιμοποιούνται αρχικά σπόροι σπαραγγιού (εγγενής πολλαπλασιασμός). Ένας εναλλακτικός και πιο σύγχρονος τρόπος αγενούς πολλαπλασιασμού είναι ο μικροπολλαπλασιασμός (micropropagation). Η ιστοκαλλιέργεια του σπαραγγιού γίνεται με την χρήση μασχαλιαίων οφθαλμών, ακραίων μεριστωμάτων, έκφυτων υποκοτυλίων και ριζιδίων. Στόχος της παρούσης πειραματικής εργασίας είναι να αξιολογηθεί η επίδραση διαφορετικών μεθόδων βλάστησης σπόρων σπαραγγιού (A. officinalis L. var. argenteuil), αξιοποιώντας διαφορετικά υποστρώματα καλλιέργειας σε in vitro συνθήκες. Για το σκοπό αυτό, έγινε προμήθεια σπόρων του φυτού A. officinalis L. var. argenteuil, οι οποίοι καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλα θρεπτικά υποστρώματα. Χρησιμοποιήθηκαν υποστρώματα σε στερεή μορφή (εμπλουτισμένα με 8g/ L άγαρ) και υγρή μορφή (χωρίς στερεοποιητικό). Το στερεό υπόστρωμα με βάση το Murashige και Skoog, 1962 ενισχύθηκε με myo-Inositol 100mg/L, Thiamina 2mg/L και σακχαρόζη 30gr/L. Στα υγρά υποστρώματα η οξυγόνωση του υπό καλλιέργεια φυτικού υλικού (σπόρου), επιτεύχθηκε με τη χρήση αδρανών υλικών (inert materials), όπως βαμβάκι και περλίτης, καθώς και καλλιέργεια σε υγρό ανακίνησης (liquid-shake culture) με τη βοήθεια μιας συσκευής συνεχούς ανάδευσης (rotary shaker). Αμφότερα τα θρεπτικά υποστρώματα (στερεά και υγρά) εμπλουτίστηκαν με 6-βενζυλαμινοπουρίνη (BAP) 0.5mg/L. Δοκιμάστηκαν τέσσερις μεθοδολογίες βλάστησης: α) Μάρτυρας δεν έγινε καμία μεταχείριση στο σπόρο, β) Ενυδάτωση των σπόρων για 12h σε θερμοκρασία δωματίου (24-25°C) και στρωμάτωση για 5 ημέρες στους 5ᵒC, γ) Ενυδάτωση των σπόρων για 12h σε θερμοκρασία δωματίου (24-25ᵒC), στρωμάτωση για 5 ημέρες στους 5ᵒC και soaking για 24h στους 24-25ᵒC, δ) Μηχανικό σκαριφάρισμα με τρύπημα μικροπύλης. Σε συνδυασμό με τις τέσσερις προαναφερόμενες μεθοδολογίες, αξιολογήθηκαν τέσσερα διαφορετικά υποστρώματα καλλιέργειας των σπόρων: α) υπόστρωμα των Murashige and Skoog, 1962 στερεοποιημένο με άγαρ β) υγρό υπόστρωμα με μέσο στήριξης των σπόρων το βαμβάκι, γ) υγρό υπόστρωμα με μέσο στήριξης των σπόρων τον περλίτη και δ) καλλιέργεια σε υγρό ανακίνησης (liquid-shake culture) με τη βοήθεια ενός περιστροφικού αναδευτήρα συνεχούς ανάδευσης (rotary shaker). Για την καλλιέργεια των σπόρων στο στερεό υπόστρωμα και στα υγρά υποστρώματα με τη χρήση αδρανών υλικών (βαμβάκι και περλίτης) χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία Petri. Η καλλιέργεια των σπόρων σε υγρό ανακίνησης έγινε σε περιστροφικό αναδευτήρα συνεχούς ανάδευσης (rotary shaker). Ο συγκεκριμένος αναδευτήρας προγραμματίστηκε στις 90 στροφές/min (rpm-revolution per minute), θερμοκρασία 25ᵒC, 16 ώρες φωτοπερίοδο και ένταση φωτισμού 10.000 Lux. Στην περίπτωση αυτή αντί για τρυβλία χρησιμοποιήθηκαν κωνικές φιάλες τύπου Erlenmeyer των 250ml. Για κάθε υπόστρωμα αξιοποιήθηκαν 7 τρυβλία και σε κάθε ένα καλλιεργήθηκαν 8 σπόροι (7 x 8 = 56). Για την καλλιέργεια σε υγρό ανακίνησης (liquid-shake culture) αξιοποιήθηκαν 6 κωνικές φιάλες/μεθοδολογία με 8 σπόρους/φιάλη. Συνολικά καλλιεργήθηκαν 864 σπόροι, (4 μεθοδολογίες x 216 σπόροι). Η επώαση των σπόρων έγινε σε ελεγχόμενες συνθήκες (θερμοκρασία 25ᵒC, 16 ώρες φωτοπερίοδο και ένταση φωτισμού 3.500 Lux.) για 40 ημέρες. Ακολούθησε η αξιολόγηση καταγράφοντας τον αριθμό και το μήκος των βλαστών, τον αριθμό και το μήκος των ριζών, καθώς και το νωπό και ξηρό βάρος κάθε συστάδας. Η στατιστική δοκιμασία έγινε συγκρίνοντας τις μέσες τιμές με τη δοκιμή Duncan. Από την στατιστική ανάλυση προκύπτει ότι, οι μέθοδοι βλάστησης δεν επηρέασαν κανένα από τα αξιολογημένα χαρακτηριστικά με τις τιμές να προσεγγίζουν εκείνες του μάρτυρα. Σε αντίθεση με τις μεθόδους βλάστησης, στις επεμβάσεις (υποστρώματα) καταγράφεται μια σημαντική επίδραση, συγκεκριμένα: στο στερεό υπόστρωμα (μάρτυρας) αναπτύχθηκαν περισσότερες και με μεγαλύτερο μήκος ρίζες, ενώ στο υγρό ανακίνησης προέκυψαν περισσότεροι και με μεγαλύτερο μήκος βλαστοί, ευνοώντας παράλληλα την απόδοση σε νωπό και ξηρό βάρος. Όσον αφορά τις στατικές υγρές καλλιέργειες με συστήματα υποστήριξης (βαμβάκι, περλίτης), εμφανίζουν σημαντική υστέρηση σε όλα τα αξιολογημένα χαρακτηριστικά. Σχετικά με την ταχύτητα βλάστησης των σπόρων, προκύπτει μια σαφής υπεροχή στους σπόρους που καλλιεργήθηκαν στο στερεό υπόστρωμα, καθώς και στο υγρό ανακίνησης και στις τέσσερις μεθόδους ανάπτυξης.

Asparagus officinalis L is a perennial wild and cultivated species belonging to the Asparagaceae family. Out of the 200 species of the genus Asparagus, A. officinalis is the most common edible species. Asparagus consists of the underground part (root and fleshy roots - crown) and the aboveground (shoots - spears, leaves and flowers). Is a dioecious, rarely andromonoecious, monocotyl and reaches a height of 1 to 2 meters. Its flowers are solitary or in pairs of 2-3. There are homogametic female species (ΧΧ), heterogametic male species (XY) and homogametic male species (YY). The last were created through breeding heterogametic males. Heterogametic males are considered more productive than females, while homogametic males are more resistant to various diseases and do not produce seeds. The propagation of asparagus is achieved with rhizomes (crowns - vegetative multiplication), but seeds (sexual multiplication) are initially used to produce them. An alternative and more modern way of vegetative reproduction is micropropagation. Shoot apexes, nodal segments, hypocotyls and roots are used as explants for the micropropagation of Asparagus. The present thesis aims to assess the effectiveness of different germination methods of asparagus seeds by exploiting different culture media under in vitro conditions. For this purpose, seeds of var. Argenteuil were supplied and cultivated on suitable culture media. Substrates were used in solid (8g/ L agar added) and liquid form (without solidifier). The solid substrate based on Murashige and Skoog (1962) was enriched with myo-inositol 100mg/L, thiamine 2mg/L and sucrose 30g/L. In liquid substrates, the oxygenation of the growing seeds was achieved by using inert materials, such as cotton and perlite, as well as cultivation in liquidshake culture on a rotary shaker. Both nutrient substrates (solid and liquid) were reinforced with 6-benzylaminopurin (BAP) 0.5mg/L. Four germination methods were tested: a) No treatment (control), b) Hydration of seeds for 12h at room temperature (24-25ᵒC) and stratification for 5 days at 5 ᵒC, c) Hydration of seeds for 12h at room temperature (24-25ᵒC), stratification for 5 days at 5 ᵒC and soaking for 24h at 24-25ᵒC, d) Mechanical scarification by piercing the micropyle. In combination with the four mentioned methodologies, four different seed culture media were evaluated: (a) solid substrate of Murashige and Skoog (1962), (b) liquid substrate with cotton as seedling support material, (c) liquid substrate with perlite as seedling support material and (d) liquid-shake culture. Petri dishes were used for seed cultivation in solid and liquid media with the support of 10 inert materials (cotton and perlite). For liquid-shake culture, 250ml Erlenmeyer flasks were used and programmed at 90 rpm, a temperature of 25ᵒC, 16h of photoperiod and a lighting intensity of 10,000 Lux. Seven Petri dishes were used for each substrate and 8 seeds (7 x 8 = 56) were grown in each substrate. For the liquid-shake culture, 6 Erlenmeyer flasks/methodology with 8 seeds/flask were used. A total of 864 seeds were grown (4 methodologies x 216 seeds). The seeds were incubated under controlled conditions (temperature 25ᵒC, 16h photoperiod and lighting intensity 3,500 Lux.) for 40 days. Τhe evaluation was based on the selected data of number and length of stems, the number and length of roots, as well as the fresh and dry weight of each cluster. Averages of taken data were compared using Duncan’s Multiple Range Test (MRT). Germination methods did not affect the evaluated characteristics of sprouted asparagus seeds. The values ranged close to those of the control. Generally, the assessed characteristics were influenced by the type of nutrient substrate. Specifically, the solid substrate favored the development of roots larger in amount and size. Also sprouted seeds grown in liquid-shaking culture developed longer stems in larger amounts, while seeds grown in static liquid culture performed poorly in all evaluated characteristics. However, seeds grown on solid and liquidshaking substrates showed a higher germination rate as well as a high rate of germination capacity in all four methods examined.